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      核酸適配體在質譜中的應用與展望

      發布時間:2020-12-22 10:22所屬分類:化工生產加入收藏

      摘 要 核酸適配體(簡稱適配體)是一類重要的化學抗體型功能性生物分子,基于適配體的質譜技術在提供分子質量及結構特征等基礎上,兼具了針對靶分子

        摘 要 核酸適配體(簡稱適配體)是一類重要的“化學抗體”型功能性生物分子,基于適配體的質譜技術在提供分子質量及結構特征等基礎上,兼具了針對靶分子的高選擇性及親和富集特點,從而提供出高特異、高靈敏信息。本文綜述了近年來適配體在質譜分析中的應用進展,重點評述了適配體在質譜分子相互作用表征中的應用、適配體作為離線型和在線親和材料用于質譜分析測定等現狀,其中結合多種質譜新技術, 通過創建或結合多種前處理或在線一體化信號增強方式,特別是適配體功能化納米材料的應用,在相互作用表征、痕量靶分子選擇性提取和高靈敏檢測等質譜分析測定方面是研究的重點。最后,本文對適配體在質譜研究中的應用前景進行了展望。

        關鍵詞 適配體; 質譜; 相互作用表征; 納米材料; 功能化; 評述

      化工學報

        1 引 言

        適配體是通過指數富集配體系統進化技術體外篩選得到的單鏈寡核苷酸序列,如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)序列,能特異性識別靶分子,如小分子、生物大分子(蛋白質、酶、毒素、轉錄因子等)、病原體(病毒、細菌、細胞)、組織等,具有體積較小、結構靈活、變性復性快速可逆、易功能化修飾與標記、自身穩定性強和無免疫原性等優點[1]。適配體已在分析化學、藥學、生物醫學等多個領域得到應用,例如生物傳感技術、DNA納米技術、即時診斷、藥物靶向遞送等[2]。近年來,適配體作為親和分子,已出現酶聯適配體吸附劑、適配體型固定相、陣列式芯片、酶微反應器等多種形式,繼而結合生物傳感器、色譜、質譜(MS)等進行分析檢測。

        核酸適配體在質譜中的應用研究可分為兩類模式: 一類是針對所形成靶分子-適配體復合物的天然結構進行質譜表征; 另一類是利用親和材料,由生物相容性載體(如磁珠、樹脂、納米粒子等,負載適配體親和分子)對分析物靶分子進行特異性提取、富集和凈化,再對所捕獲到的分析物進行質譜分析。適配體可作為離線前處理式親和材料,需要采取合適的洗脫方式洗脫相對純凈的分析物,再進行質譜鑒定或液相色譜-質譜定量分析; 或直接用于在線親和捕獲富集和質譜靶向鑒定/測定“一體化”分析。

        2 適配體在質譜分子相互作用表征中的應用

        盡管已產生了具有高親和力和選擇性的多種靶分子的適配體,但缺乏高分辨率的結構數據以及當前各種生物物理表征方法的局限性等因素極大地阻礙了對適配體-靶分子相互作用機理的研究。質譜技術,特別是高分辨質譜技術,是靶分子-適配體相互作用表征的有力工具,可提供復合物分子量、結合比、選擇性以及相互作用位點解析等多種信息。但是, 當適配體作為相互作用分子之一時,難點在于包括寡核苷酸在內的生物大分子電離效率低、相互作用結合位點解析困難,相互作用結構易受周圍環境影響等,優點在于可以創造環境保持靶分子-適配體復合物的天然構象、特異性強、免標記、檢測快速、樣品量低、高通量等。基質輔助激光解吸電離-質譜技術(MALDI-MS)和液相色譜-電噴霧電離串聯質譜技術(LC-ESI-MS/MS)是其中的代表性技術,交聯結合質譜(XL-MS)、非變性質譜(Native MS)、氫/氘交換質譜(HDX MS)、自上而下質譜(Top-Down MS)、離子淌度聯用質譜(IMS-MS)等工具則為之注入了新的活力。

        引入化學交聯方法,可精確繪制相互作用位點圖譜。1999年,Golden等[3]首次利用ESI-MS鑒定了堿性成纖維生長因子155(bFGF155)與其內嵌5-溴-2-脫氧尿嘧啶(BrdU)的61 mer 適配體復合物,分別使用胰蛋白酶酶解、蛇毒磷酸二酯酶/堿性磷酸酶酶解,結合碰撞誘導電離(CID),確定出結合位點為bFGF155的一條九肽TGQY133KLGSK與61 mer適配體中的一個二聚核苷酸等。2017年,Lu等[4]結合XL-MS,設計了一種新穎的多功能化學探針,其結構中含有組蛋白H4的適配體序列、生物素標簽、用于光交聯的芳基疊氮光敏基團,以及使適配體與組蛋白易于解離的二硫鍵,實現了組蛋白H4的選擇性標記和高效富集,并首次揭示出組蛋白H4與其適配體的結合區域處于N-末端尾部。

        對非共價復合物可以直接進行質譜表征,無需化學交聯。2005年,Keller等[5]報道了小分子(如妥布霉素、三磷酸腺苷(ATP)和核黃素等)與各自適配體在ESI-MS中的識別行為,發現氫鍵、π-π堆積對相互作用起到主要作用,但某些高親和性適配體在氣態電離時因為高庫侖斥力而導致穩定性下降。2018年, Gulbakan等[6]首次使用非變性ESI-IMS-MS,提供了大量關于小分子(如腺苷、L-精氨酰胺、可卡因等)與適配體相互作用的基礎信息(圖1),發現電荷狀態與適配體寡陰離子構象間的相關性,提示適配體-小分子相互作用在較低電荷態的復合物離子中得到更好保留,而較高電荷態的復合物離子在氣相中更易解離,并揭示了化學計量結合比、結合特異性、小分子選擇性以及適配體-小分子結合中的協同作用等。

        2013年,Chen等[7]首次報道了蛋白質-適配體復合物在MALDI-MS中的成功表征,僅需低樣品量(1 pmol)和小體積(1~10 μL),使用非酸性基質6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶(ATT),可觀察到凝血酶-凝血酶適配體(TBA)15/TBA29、血小板衍生生長因子-AB/BB及其適配體的非共價復合物峰,并可用于親和力高低排序。2014年,Trelle等[8]利用HDX-MS研究了RNA適配體對靶蛋白-纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)的構象影響。PAI-1存在從活性構象到無活性構象(潛在狀態)的過渡,此種過渡是折疊的蛋白質結構域未被共價修飾時可發生的最大的構象變化之一。研究發現,加入RNA適配體使RAI-1攝取氘的速率明顯下降,活性構象得以穩定,進一步證實了適配體結合區域屬于過渡態的結構不穩定區域(圖2)。

        非變性質譜是揭示結合比和推測結合位點的有力工具。2017年,Zhang等[9]通過高分辨傅立葉變換離子回旋共振(FTICR-MS)及四極桿-飛行時間串聯質譜(QTOF-MS/MS)表征了凝血酶-TBA復合物。凝血酶和TBA15結合比受溶液離子強度影響,20~200 mmol/L NH4Ac存在時,凝血酶-TBA復合物呈1∶2型到1∶1型的變化,反映了該相互作用受靜電作用調控的特性,進一步根據電子捕獲電離(ECD)-MS推斷出凝血酶和TBA間的可能結合位點為其纖維蛋白原結合位點,與晶體學數據一致。

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